分光光度计进行核酸定量的原理

      紫外分光光度计已经成为现代分子实验室常规仪器。紫外分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

      核酸的定量是紫外分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。

      核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值 分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

      根据比尔定律可得，在稀溶液的条件下，物质的吸光度或者荧光值可正比于溶质的浓度。所以当我们配有一定梯度浓度的溶液时（注意这些浓度时已知的），然后分别测量该溶液的吸光度或者荧光值，拟合出一条吸光度或者荧光值和浓度的关系曲线（一般来说比较常用的是一元一次曲线），然后根据这条曲线表达出的吸光度或者荧光值和浓度的关系就可以计算出待测溶液的浓度了。以上的这个过程用术语来说就是“定量分析”。

      测试前，输入原液和稀释液的体积，然后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。我们使用了日本进口滨松CCD元器件，保证了设备的高度线性一致性，在稳定的测量支架的帮助下，测量数据更精准。当然我们更推荐使用遮光环境，让测量精度得到保证。

      事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在多次测试的结果在均值0.3%左右之间变动。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，可大大稳定读数。

     样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。

      最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色皿测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色皿；样品的体积必须达到比色皿要求的最小体积等多个操作事项。

      除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。